免疫染色 英語 ihc

Horizon社Dharmacon製品(メーカー略称：DHA)のRNAiコレクション，cDNAコレクション，Yeastコレクションなど，遺伝子機能研究に有用な遺伝子リソースを検索することができます。免疫染色(IHC)実験の操作方法を動画で分かりやすくご説明いたします。目的に応じた免疫染色(IHC)用製品をご検索いただけます。下記アイコンをクリックしてください。TransOMIC Technologies社(メーカー略称：TOT)のRNAiコレクション，cDNAコレクション，Yeastコレクションなど，遺伝子機能研究に有用な遺伝子リソースを検索することができます。抗原賦活化専用に開発された装置で，USBメモリーに作動中の内部圧力値や温度，処理時間の実測データを保存することが可能です。パラフィン包埋切片を接着させた免疫組織化学染色用スライドを，速やかに乾燥できるオーブンです。25～100℃の温度設定が可能です。OriGene Technologies社(メーカー略称：ORI)のTrueClone / TrueORF / TrueORF Gold cDNAクローンなど，遺伝子機能研究に有用な遺伝子リソースを検索することができます。 免疫組織化学染色 (IHC) は、構造が保持されている組織サンプルでタンパク質の発現を解析する、抗体ベースの技法です。IHCの技法を用いた研究成果は、1942年にCoons博士らによって初めて報告されました。 1. (2012) Clin Cancer Res 18, 4449-4457)。IHCは抗体と抗原の関係を利用して、生体切片上で生体内原位置 (in situ) のタンパク質発現を視覚化する手法です。この手法には、組織サンプルの解剖学的、構造的情報を保持したまま解析できるという特長があります。このため、構造の維持されたサンプルでタンパク質を高い分解能で可視化し、これが細胞内のどの区画に局在するかを解析することができます。つまり、IHCは免疫学的検出手法と顕微鏡解析を組み合わせた、効率よく簡便な、けれども応用範囲の非常に広い解析手法です。染色のためにサンプルを切片化する必要があるため、固定操作の後、薄切できるように組織をブロック状態に安定化させます。選択した固定法によって組織ブロックのタイプ、包埋剤は異なり、パラフィンベースのもの (ミクロトームで薄切)、温度感受性のある水溶性のもの (クリオスタットで薄切)、寒天 (ビブラトームで薄切) などを使用します。一次抗体は標的タンパク質内にあるアミノ酸の特定の配列 (エピトープ) を認識するため、抗原の動物種 (すなわちヒトかマウスか) によって反応性が異なることがあります。すなわち、正確にエピトープに一致したアミノ酸配列を持つ抗原タンパク質に対して最良の結果が得られます。例えば、組織サンプルがヒト由来であれば、ヒト抗原への反応性が確認された一次抗体を使用すべきです。エピトープは異なる動物種間でよく保存されている場合もあり、全く異なる場合もあります。交差性を考慮して賢い抗体の選択をしてください。臨床の場において、IHCは病理学的診断と解析に利用されています。これによって組織サンプルを解析し、腫瘍の形成や転移、感染や炎症反応の病理診断を行います。また、薬剤開発など生物医学的研究の場においても、IHCは解析対象のタンパク質を検出するために、様々な形で利用されています。一次抗体反応の前に、サンプルのブロッキングを行う必要があります。このステップは、組織内の標的以外のタンパク質に抗体が非特異的結合することを避けるためのものです。組織または抗原がホルマリン固定に適していない場合は、サンプルをパラホルムアルデヒド (PFA) で固定するか、温度感受性のある超低温保存に適した材質で包埋し、液体窒素で瞬間凍結します。どちらの場合も凍結組織は冷却したミクロトームまたはクリオスタットで薄切にし、スライドに封入します。この方法はFFPEよりずっと簡単に組織切片を調製できますが、形態の保存性はあまりよくありません。凍結切片を調製する場合も、凍結による組織の損傷を低減するため、凍結の前に浸透操作で水分子を除去する必要があることにご注意ください。固定していない組織は、切片をスライドに置いた後固定後のステップを行います。クリオスタットで作成した切片をスライド上に置いたら、短時間乾燥させることが必要な場合もあります。凍結切片組織の場合も目的の抗原のアクセシビリティによっては、FFPE組織と同様に抗原賦活のステップが必要です。別法として、固定した組織自体を包埋することなく、刃を細かく振動させたミクロトーム (ビブラトーム) で直接薄切することもできます。組織は寒天に可逆的に包み込み、ビブラトームで切るのにちょうど良く安定させます。この切片は生理食塩水中で保存し、ウェルで染色することができます。このような切片は厚さがかなりあることが多く、抗体が十分に浸透しない場合があります。しかし組織の完全性は良く保持され、試薬の使用量は最小限に留めることができます。切片は免疫染色操作の後封入します。この場合、組織切片の染色は必要ありません。蛍光検出および発色検出システムを用いて、これら2つの免疫チェックポイントタンパク質の発現パターンと発現レベルを評価するために、PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684 (左)、B7-H4 (D1M8I) XP® Rabbit mAb #14572 (中央)、Pan-Keratin (C11) Mouse mAb #4545 を用いて、卵巣がんの連続切片で免疫組織化学染色をしました。注意：異なる撮像視野の画像を取得しました。同一タンパク質を標的にする抗体でも、適する抗原賦活化方法が異なる可能性があります。クエン酸バッファーで煮沸 (左)、EDTAバッファーで煮沸 (中央)、またはペプシンで消化 (右) して抗原を賦活化したパラフィン包埋ヒト肺がん組織を、CSTのEGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb #4267または、他社のEGFR mouse mAbを用いてIHC染色しました。#4267ではEDTAで賦活化した場合により良好なシグナルが得らますが、他社のEGFR mouse mAbではペプシンで消化した場合にのみシグナルを検出しています。CSTが推奨する賦活化液を使用して、最終的な染色結果の質を高めることができます。クエン酸バッファー (左図) またはEDTAバッファー (右図) を使用して抗原賦活化した後、Phospho-HER3/ErbB3 (Tyr1289) (D1B5) Rabbit mAb #2842を用いたパラフィン包埋ヒト肺がん組織のIHC分析。この抗体 (#2842) の場合は、EDTAバッファーで賦活化した場合に細胞膜の染色が強くなり、より明瞭な染色像が得られることが分かります。それぞれの抗体に最適な賦活化条件は、製品のデータシートでご確認ください。ここでは、CSTが推奨するプロトコールの概要を提示し、どのステップが実験の成功の鍵となるかを説明します。その中で、抗体の検証やテクニカルサポートで積み上げてきたIHCの豊富な経験を踏まえ、CSTが推奨する試薬や手順を解説していきます。IHCは難しい手法で、しばしば問題が生じます。ここでは、お客様が条件検討に費やす時間を最小限に抑え、期待通りに結果が得られるよう、IHC実験のプロセスや原理を解説します。扁桃腺のFFPEサンプルにおける、PD-L2 (橙)、PD-L1 (E1L3N®)-(赤)、CD68 (緑)、PD-1 (黄)、CD8α (マゼンダ)、Pan-Keratin (シアン)。ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb 3633#を用いた、パラフィン包埋ヒト肺がんのIHC解析。ALKを高レベルに発現するサンプル (左) と、低レベルに発現するサンプル (右)。標的タンパク質の免疫標識が完了したら、シグナルの可視化が可能となります。免疫標識タンパク質を視覚化するための検出方法はいくつかあり、免疫染色のステップで使用した抗体の種類よって選択肢が変わってきます。この方法は大きく分けて、1) 発色検出と、2) 蛍光検出の2種類に分類されます。予め検出方法を決めることで、適切な一次抗体と二次抗体 (こちらが特に重要) を選択します。ここまでで、ようやく実験結果を得ることができます。発色ベースの検出法を利用した場合、呈色反応で染色された組織サンプルは、光学顕微鏡を用いて観察します。一方、蛍光ベースの検出法を利用した場合は、色素を適切に励起し、蛍光を検出する蛍光顕微鏡を用いて観察します。どちらの方法で検出した場合も、まず標的タンパク質の発現が知られているサンプルと、シグナルのないネガティブコントロールを観察することをお薦めします。そうすることで、標的タンパク質を可視化しつつ、バックグラウンドシグナルを最小限に抑えるための適切な設定を確立することができます。定量的な解析を行う場合、理想的には解析対象となるサンプルをすべて同時に染色し、イメージングする必要があります。発色または蛍光シグナルの強度は、画像解析ソフト (ImageJなど) で解析し、定量化することができます。ポジティブコントロールとネガティブコントロールを利用することで、実験の最適化と標準化を行うことができ、得られた結果が正確であることを確認できます。ポリマーベースの検出は、ビオチンベースの検出よりも高感度です。CSTの#3579 Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAbと、ビオチンベース (左図) またはポリマーベース (#8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent、右図) の検出システムを用いたパラフィン包埋ヒト肺がん組織のIHC分析。ポリマーベースの方が感度が高く、より強いシグナルが得られることがわかります。組織やそれを構成する細胞の構造を保持したまま解析をするため、これらを固定する操作が重要になります。多くの方法の中から適切な固定法を選択する必要があり、重要性が見落とされがちですが、固定操作は実験の成否に大きく関わるステップです。色々な化学物質を用いて、細胞や組織のタンパク質を強固な構造体として固定します。こうすると生きた細胞の構造を維持したままの骨格が出来上がります。化学的な固定法が一般的ですが、他にも選択肢はあります。固定法は以降のIHCステップをどのように行うかという点も考慮して、注意深く検討する必要があります。良好な染色像を得るため、サンプルの調製法は大変重要になります。組織の採取と固定はサンプルの完全性と組織内の高分子のアクセシビリティに直接影響を与え、さらに標的タンパク質の抗原性にも影響を与えます。しやがって、実験目的に応じて適切な組織の採取法、固定に用いる試薬、切片化の方法を選択する必要があります。必要だからです！実際に、ブロッキングは、一次抗体と二次抗体のサンプルへの非特異的結合を低下させます。免疫染色を成功させるには、特異的な結合が大変重要ですので、このステップを正しく行うことで、最適な実験結果に近づけることができます。固定操作の過程でマスキングされたエピトープを露出させる (抗原を賦活化する) 必要があり、このためにいくつかの方法があります。プロテイナーゼKのようなタンパク質分解酵素を用いた方法、熱処理でクロスリンクした化学結合を切断してタンパク質を解く方法 (HIER：heat-induced epitope retrieval) などです。どちらの方法もエピトープを露出させることで一次抗体のアクセスを助け、IHCによる染色が可能になります。ここまでで一次抗体と二次抗体の組み合わせを最終的に決定する準備がほとんどできました。一次抗体の特異的なアイソタイプは、モノクロナールであれポリクロナールであれ、それが産生された種によって異なることを忘れないでください。二次抗体はこのアイソタイプと合致している必要があります。すなわち、一次抗体のIgGアイソタイプを認識する抗IgG H&L (重鎖と軽鎖) 二次抗体を使用する必要があります。これを利用して、同じ動物種を宿主に作成した抗体どうしでも交差反応なく染め分けられることがあります。これについては、下の「マルチプレックス」セクションで詳説します。ホルムアルデヒド/ホルマリン固定し、パラフィン (蝋をベースにした包埋剤) で包埋した組織サンプルがよく利用されており、このタイプのサンプルはFFPE (formalin-fixed paraffin-embedded) 組織と呼ばれます。FFPE組織はミクロトームで薄切切片にし、最終的にスライドに封入します。FFPEはサンプルの長期保存に適しており、細胞表面の維持に優れるため、最も一般的に用いられる調製法ですが、切片化した後、免疫染色操作に移る前に抗原タンパク質を露出させて抗体のアクセシビリティを上げる手順が必要になります。そうした手順には、風乾、またはオーブン、電子レンジによる乾燥、有機溶媒による脱パラフィン、抗原賦活化などが含まれ、これらをすべて免疫染色操作の前に行います。特に抗原賦活化は抗原を露出させるために必要不可欠で、pH値の異なるいくつかのバッファーでサンプルを煮沸する方法や、タンパク質分解酵素で組織を消化する方法があります。すべてのDAB基質が同じように機能するとは限りません。Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145を用いたパラフィン包埋ヒト乳がん組織のIHC分析。発色検出には、SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 (左図)、他社 (Company 1) のDAB (中央図)、またはもう一つ別の他社 (Company 2) のDAB (右下図) を使用しました。Company 2のDABでは、SignalStain® DAB Substrate Kitに匹敵するシグナルが得られていますが、Company 1のDABでは、シグナルがかなり弱くなっています。別の国に変更すると、ショッピングカートの中身が失われる可能性があります。免疫染色は、細胞または組織サンプル内の特異的なタンパク質を検出するのに抗体を使用する方法すべてを指す総称です。免疫染色実験を計画するにあたり、採用するプロトコールによっていくつか検討すべき点もあります。次のリソースは、FFPE組織で最適なIHC実験をデザインし実行する際に役立てていただくことができます。上述したように、IHCの基本原理は抗体で解析対象のタンパク質を特異的に検出することです。しかしながら、実際にはそれほど単純ではなく、より複雑な要因が絡んできます。一般的なIHCの実験の重要なプロセスの概要を述べ、続いて各プロセスを詳細に解説します。IHCは応用範囲の広い強力な解析手段です。他の手法と同様に、適切なコントロールを利用してプロトコールを最適化することで、最良の結果を得ることができます。医療診断から生物医学研究における使用まで、ハイスループット解析からロースループット解析まで、IHCは様々な科学的知見を与え続けています。組織が薄切できるように安定化したら、実験目的に応じた厚さの切片を適切な装置で作成します。違いは数多くあるものの、これら切片作製用機器には共通点が一点あります：それはとても鋭い刃で、損傷をまったく残さないように組織を切片化するということです。刃の種類は使用する機器と、切片化する組織に合わせて選ぶ必要があります。また、刃はこまめに洗浄して鋭さを維持する必要があります。組織切片ができたらスライドに張り付けて風乾した後、次のステップに進みます。 免疫細胞化学(icc)と免疫組織化学(ihc)による各染色の比較。 a549ヒト腺癌細胞(上左図；icc)およびヒト結腸癌組織切片(右図；ihc)について、間接検出によってプロテインホスファターゼ2a (pp2a)を固定化および染色しました。 免疫組織化学（Immunohistochemistry：IHC）とは、目的とするタンパク質が、検体組織に存在しているか調べる検査方法です。病気を詳しく診断するためには、患部の一部を切り取り、検査（生検）する必要があります。切り取られた患部は、固められた後、薄く（5 um：1

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